FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS
U.N.L.Pam.
ASPECTOS GENERALES DE LA
VITRIFICACIÓN Y EVALUACIÓN DEL SEMEN BOVINO
Departamento: Clínicas y
Patologías
Cátedra: Clínica de Animales de Interés Zootécnico
Prof.: Jorge Merlassino
AÑO: 2011
Alumno: Esteban Ramón Alonso
Indice
Ø Carátula……………………………………………………………….……..1.
Ø Índice………….…………………………………………………………......2.
Ø Introducción……………………………………………………………...….3.
Ø Manejo y técnicas
de extracción/colección de semen…………..…6.
Ø Evaluación de la
calidad del semen…………………………………..11.
Ø Procesado,
envasado y congelado del semen………………….….21.
Ø Conclusión…………………………………………………………….……29.
Ø Bibliografía...…….…………………………………………………..….…31.
Introducción
La
extracción y congelado de semen bovino es una tecnología al servicio de la
reproducción animal, que a través de los años se ha ido perfeccionando. En un
principio se realizaba inseminación artificial con semen fresco, diluido, en
hembras previamente sincronizadas. Con el paso de los años y con el avance en
estudios realizados en el tema, se logró diluir y congelar semen, con este
avance se puede inseminar hembras en otros lugares lejanos a la ubicación del
toro donante del semen.
La
técnica de inseminación artificial permite el aprovechamiento de un macho de genética superior, con hembras de rodeo
general, para aumentar la calidad genética del rodeo, de diversos caracteres
genéticos deseados, los cuales son aportados por el macho.
La
técnica consiste en extraer semen a un toro de genética superior (elegido
mediante programas de selección), por medio de distintas técnicas de extracción
de semen, para luego diluir dicho semen, fraccionarlo, congelarlo y almacenarlo
para su posterior uso mediante la técnica de inseminación artificial.
En el proceso de congelado se somete al semen a
una serie de cambios que pueden alterar la calidad del mismo, así un semen que
al momento de congelarse es excelente, puede por diversos motivos bajar su
calidad luego de descongelado; por eso es importante analizar el semen o
algunas dosis de semen posteriormente a su descongelado.
Durante el proceso de congelado, el semen
sufre distintos procesos biológicos (complejos), que ocurren dentro de la célula, que se
asemejan a una deshidratación con la diferencia de que durante el proceso de
congelamiento, si el mismo es rápido o en un medio no apropiado, se forman
cristales de agua extracelulares.
Por lo tanto la congelación lenta le permitirá a la célula equilibrar el
contenido de agua con el medio, perdiendo agua y evitando de esta manera la
formación de cristales y al mismo tiempo ir deteniendo los procesos enzimáticos
celulares.
A los -10 o -15°C la cantidad de agua
intracelular es baja, baja la presión intracelular y aumenta la concentración
de soluto, pudiendo provocar la muerte celular si la célula es congelada por
debajo de la velocidad crítica (demasiado lento); pero si por el contrario son
congeladas por encima de la velocidad crítica (demasiado rápido), el daño puede
sobrevenir debido a que la elevada cantidad de agua intracelular provoca la
formación de cristales.
En resumen algunos de los procesos biológicos
que pueden alterar la viabilidad del semen son los siguientes: Formación de
cristales de agua extracelulares que pueden provocar la muerte celular. Alta
concentración de solutos, que alteran las proteínas. Variaciones de PH. Y
deshidratación que lleva a la precipitación de las proteínas.
Para disminuir estos efectos negativos en el
semen se utilizan crioprotectores, como por ejemplo el glicerol, que actúa
reduciendo los electrolitos en el agua no congelada en la célula y alrededor de
ella y además protege la superficie celular.
Además de crioprotectores, al semen se le
agregan diluyentes, los cuales tienen como función: aportar nutrientes como
fuente de energía, disminuyen en efecto del enfriamiento rápido, actúan como
amortiguadores de PH, mantienen la presión osmótica y el balance electrolítico,
inhiben la proliferación bacteriana, aumentan el volumen del semen, protegen al
semen durante el congelamiento.
El proceso de descongelamiento también es un punto
crítico, si el mismo es lento
(temperatura inferior a 32°C), ocurre un fenómeno de recristalización,
que son grandes cristales de agua que causan daño mecánico grave; mientras que
un descongelado rápido (temperaturas superiores a los 38°C) impide la formación
de cristales de agua, produce mayores daños por efecto de la disolución. Por
esto es que se recomienda que el descongelado se realice entre los 35 y 37°C de
temperatura.
Algunas ventajas y desventajas de la
utilización de semen congelado en la inseminación artificial:
·
Ventajas:
ü Control
de enfermedades venéreas
ü Permite
el uso generalizado de machos sobresalientes con genética superior, a un precio
relativamente económico, para rodeos generales.
ü Facilita
las pruebas de progenie en diversas condiciones ambientales y de manejo,
mejorando de este modo la exactitud de selección.
ü Se
acorta el tiempo de introducción de un carácter genético deseado.
ü Hace
posible el uso de un macho de genética superior y comprobada que ya ha muerto.
ü Permite
el uso de semen de machos con problemas de copulación.
ü “Consiste
en poder fecundar las vacas con un toro cuyo potencial genético de mejoramiento
sea conocido. Facilita el rápido mejoramiento de un rodeo o el cruzamiento de
otras razas. Ayuda al control de las enfermedades, al usarse semen libre de
enfermedades contagiosas y venéreas. Es económico y eficientemente manejado con
idoneidad”. Dr. Alfredo Witt.
·
Desventajas:
v Personal
capacitado.
v Infraestructura
mínima (corrales, yugo, etc.).
v Mala
elección de un toro.
v Mal
estado corporal de las vacas.
v Error
o mala elección del protocolo de sincronización.
v
Mal manejo del semen (termos con
falta de nitrógeno liquido, etc.)
Manejo y
técnicas de extracción/colección de semen en el toro
Un
toro está apto para extraerle semen a partir de los 12 meses de edad, siempre y
cuando haya tenido un buen manejo y una correcta alimentación. Con respecto a la cantidad de
veces por día que se aconseja realizarle la extracción de semen,, es dos veces
por día, tres veces por semana aproximadamente,
dependiendo de la edad, del manejo, del estado del todo etc.
Para
la extracción de semen, hay que estimular a los toros, esto puede ser mediante
montas vivas, como por ejemplo hembra estimuladora, otro macho (entero o
castrado), o mediante montas no vivas como es el caso de los maniquíes (fijos o
móviles). El toro se estimula mediante el reflejo de inmovilidad que presentan
los animales o maniquíes estimuladores; para que los animales estimuladores se
queden inmóviles se utilizan bretes (fig. 1).
Fig.
1. Bretes inmovilizadores.
Algunos métodos de extracción/colección de semen:
Si
bien hay muchos métodos de extracción de semen, el más utilizado y de
preferencia en los centros de reproducción es el de la vagina artificial,
pero también se detallaran otros como
por ejemplo: electroeyaculador, técnica de la mano enguantada, masaje rectal,
método de la esponja, estos últimos no han tenido buenos resultados.
Ø Vagina
artificial: el modelo de vagina
artificial más utilizado es el tipo danés, es un tubo cilíndrico de caucho, con
un orificio y un tapón para la introducción de agua caliente, por dentro tiene
un revestimiento interior de látex delgado, un cono recolector de látex en uno
de los extremos, un tubo de ensayo de recolección en el extremo libre del cono
y ligaduras que sujetan el revestimiento interno de látex al tubo cilíndrico
(Fig. 2). El espacio q queda comprendido entre el tubo de caucho y el
revestimiento interior de látex, se llena de agua caliente (entre 60 y 70 °C),
la cubierta aislada permite garantizar que la vagina artificial se mantendrá
aproximadamente en 45°C. En el interior de la vagina artificial se coloca un
lubricante estéril.
Para la utilización de este método, hay que recordar que los toros deben
ser dóciles.
La estimulación se realiza con animales inmovilizados o con maniquíes,
como ya se menciono anteriormente, esta consiste en tres a cinco montas falsas
y restricción activa; después de la estimulación, se permite montar al animal
estimulador o al maniquí, al momento que va a introducir el pene dentro de la
vagina, el operador con la vagina artificial, le desvía el pene y lo coloca
dentro de la vagina artificial, la cual se mantiene paralela al flanco del
animal estimulador; al tener contacto con la superficie tibia, el toro eyacula
inmediatamente dentro de la vagina artificial, la misma inmediatamente se
inclina hacia abajo, en dirección al tubo de ensayo, colectando todo el semen
del eyaculado (Fig. 3).
Fig. 3
Ø Electroeyaculador: Este método se reserva para aquellos toros que no
están acostumbrados a eyacular con la vagina artificial, y también para
aquellos toros que tienen problemas en las patas o que son muy viejos y no les
es posible realizar el salto.
Fig. 4
El método consiste en introducir la sonda o vástago,
con los electrodos hacia ventral (contactando con las glándulas sexuales
accesorias), por el recto del toro, se estimula eléctricamente a los nervios de
la reproducción, provocando la erección con el posterior eyaculado; el aparato
debe ser manipulado por un operador con experiencia, ya que se comienza con un
voltaje bajo y se va aumentando a medida q el operador crea necesario hacerlo
para provocar el eyaculado. El mismo es recogido por un ayudante que se
encuentra “sujetando” el pene. (Figs. 4 y 5).
Fig. 5
Ø Método de
la esponja: Este método consiste
en introducir una esponja dentro de la vagina de la hembra, luego que se
produce el coito entre el macho y la hembra la esponja es retirada, la misma se
comprime y se recoge el semen. Esta técnica no ha dado muy buenos resultados,
ya que el semen recolectado está en su mayoría muerto o no es viable.
Ø Masaje
rectal: Esta técnica consiste en introducir un brazo en el
recto, y masajeando las glándulas sexuales accesorias provocar la erección y
eyaculación del toro. Esta técnica tiene que ser aplicada por un profesional
experimentado, pero es costoso que el animal eyacule por este método.
Ø Técnica de
la mano enguantada: Esta
técnica puede acompañarse con la mencionada anteriormente, pero en bovinos
tampoco tiene muy buenos resultados; la misma consiste en tomar el pene
(previamente exteriorizado) con la mano con un guante, y ejercer cierta presión
y movimientos “masajeadores” para provocar la eyaculación del toro.
Evaluación
de la calidad del semen
La
evaluación del semen es un punto importante, previo al congelado del mismo,
para determinar la fertilidad de un reproductor, si bien existen otras pruebas
complementarias a la evaluación del eyaculado, ésta (la evaluación del semen
con todas las pruebas que implica) es con certeza el método que van a dar como
apto o rechazar a un reproductor.
“Es
el método estándar para evaluar la fertilidad de machos reproductores, aparte
de la evaluación directa de su capacidad para causar preñez, es el examen del
semen”.Hafez.
Luego
de la extracción, por cualquier de los métodos antes mencionados, se llevará la
muestra lo más rápido posible al laboratorio, donde se realizaran diversas pruebas para comprobar
que ese toro es apto para ser utilizado como reproductor.
Las
pruebas constan de una evaluación
macroscópica (aspecto y volumen) y una evaluación microscópica (motilidad
espermática-motilidad en masa, motilidad progresiva-, relación vivos-muertos,
concentración y morfología) de la muestra.
Si
bien existen muchas pruebas y métodos para determinar la calidad del semen, se
citaran aquellas que son más utilizadas.
Dentro
de la evaluación macroscópica del semen
se analizará: aspecto y volumen. Figura 6, 7, 8, 9.
Figura
6.Fuente: terrastock.com.br
Figura
7.Fuente: Apuntes de Obstetricia y Fisiopatología de la Reproducción
Figura
8. Fuente: Apuntes de Obstetricia y Fisiopatología de la Reproducción
Figura
9. Fuente: Apuntes de Obstetricia y Fisiopatología de la Reproducción
El volumen
promedio de eyaculado de un buen toro es aproximadamente de 5-8 ml., hasta 4
ml., sería un eyaculado regular, y menos de 3 ml. sería un mal eyaculado. Hay q
tener en cuenta la frecuencia de extracción de semen, porque puede ser causa de
una disminución de volumen en aquellos toros que se les extrae más de dos veces
por día; otra salvedad es que los toros jóvenes y de menor talla, producen
menor volumen de semen.
En
cuanto al aspecto, debe ser
cremoso, opaco y relativamente uniforme, esto es indicativo de una alta
concentración espermática. Las muestras translucidas contienen pocos
espermatozoides, las muestras lechosas hay que considerarlas regulares, en las
muestras de color amarillo hay q observar que no estén mezcladas con orina (le
da un olor característico a la muestra), pero también algunos toros producen
semen de color amarillo por la presencia inocua de riboflavina.
La
muestra tiene q estar libre de pelo, suciedad, sangre, grumos, etc.
Características de un eyaculado normal
|
|
Volumen
|
5-8
ml.
|
Concentración
|
800-2000
millones/ml
|
Motilidad
|
40-75%
|
Normales
|
65-95%
|
PH
|
6.4-7.8
|
Fuente:
Apuntes de Obstetricia y Fisiopatología de la Reproducción
Para
la evaluación microscópica, es
necesario, contar con los siguientes materiales:
1- Un buen
microscopio, o un microscopio de contraste de fase; permite observar
estructuras no teñidas y en preparaciones vivas o húmedas en portaobjetos.
Figuras 10 y 11.
2- Platina térmica,
importante dado que la temperatura incide en forma notoria sobre la actividad
del espermatozoide. Figura 12.
Figura12. Fuente: Apuntes de Obstetricia y Fisiopatología de la
Reproducción
3- Baño María,
regulado en 37° C para mantener las muestras de semen y de diluyentes por un
tiempo determinado.
4- Portaobjetos,
cubre, micropipetas, etc. Figura 13.
Figura13. Fuente: Apuntes de Obstetricia y Fisiopatología de la Reproducción
Concentración
espermática: se toma una
micromuestra de 50 microlitros con una micropipeta de la muestra de semen, se
hace una dilución en 10 ml. de agua (dilución 1:200), homogeneizar y
colocar en una cámara de Neubauer, dejando
reposar 5 minutos. Luego se realiza el conteo, se cuentan 16 cuadrados de cada
uno de los recuadros que hay en los extremos, el resultado se multiplica por 4.
Por último se realiza el cálculo correspondiente, el resultado es millones de
espermatozoides/ml.
Cálculo=N° de espermatozoides
contados x 10 (altura del cuadro) x 1000 (pasaje a ml) x 200 (dilución) = N° de
espermatozoides (millones)/ml.
Figuras 14 y 15. Cuadrados que se deben contar
en la cámara de Neubauer.
Figuras 14 y 15. Fuente: Apuntes de Obstetricia y Fisiopatología de la Reproducción
Micropipeta y cámara de Neubauer. Fuente: Apuntes de Obstetricia y Fisiopatología de la Reproducción
Morfología
espermática: Algunos factores
que influyen en la morfología espermática son: estrés por calor, períodos de
temperatura ambiental elevada, índices altos de humedad (acompañando a lo
anterior), estos factores afectan la morfología por un tiempo aproximado de 6
semanas.
Las anormalidades se clasifican en primarias,
secundarias y terciarias. Las primarias se relacionan con defectos en las
cabezas espermáticas y el acrosoma; las secundarias se relacionan con la
presencia de una gota en la porción media de la cola; las terciarias se
relacionan con defectos en la cola.
La forma de evaluar la morfología es la
siguiente, se coloca una gota de semen, más una gota de eosina-nigrosina,
previo se diluye el semen al igual que en la prueba anterior, se lleva al
microscopio, se observa con el objetivo de 1000 aumentos, bajo inmersión, y se
observan y cuentan al menos 200 espermatozoides.
El mínimo aceptable es de 70% de
espermatozoides normales.
Relación
vivos/muertos: Esta prueba se
realiza combinada con la anterior, se coloca una gota de semen y se tiñe con
eosina-nigrosina, se lleva al microscopio y se observa y cuentan la cantidad de
vivo y muertos, se considera un valor mínimo de 30% de espermatozoides vivos.
Esta prueba permite reemplazar a la prueba de motilidad progresiva, cuando no
se cuenta con una platina térmica y un microscopio adecuado al momento de evaluar
el semen.
Motilidad
espermática:
Esta prueba hace referencia a la estimación subjetiva de la viabilidad
espermática y la calidad de los mismos. Esta prueba debe ser realizada lo más
rápido posible una vez colectada la muestra, por una cuestión de temperatura,
debido a que las variaciones de temperaturas influyen notablemente sobre la
motilidad. La evaluación de la prueba se realiza con un microscopio de luz
directa, con contraste de fases. Las determinaciones más frecuentes a evaluar
dentro de la movilidad, son movilidad en masa y motilidad progresiva.
Motilidad
en masa:
Esta prueba se realiza con semen no diluido, se toma una gota de la muestra y
se coloca sobre el portaobjeto, previamente calentado en la platina térmica,
luego el portaobjeto es llevado al microscopio y se analizara, se observa a
poco aumento, los bordes de la gota y la zona del centro hasta el borde de la
misma. Para la valoración de la prueba se utiliza una escala subjetiva que va
del 0 al 5.
0=ausencia de
espermatozoides.
1=algunos espermatozoides se
mueven en su sitio.
2=presencia de
espermatozoides móviles, pero no alcanzan a formarse ondas, menos del 50% de
espermatozoides móviles.
3=se observa formación de
ondas o remolinos muy lentos, de 50%-70% de espermatozoides móviles.
4=formación de ondas o
remolinos rápidamente, de 70%-90% de espermatozoides móviles.
5=la velocidad de formación
de ondas es muy alta, más de 90% de espermatozoides móviles.
Los eyaculados que clasifiquen con 2 o menos
deben ser descartados.
La motilidad en masa depende de:
concentración, velocidad de movimiento de los espermatozoides y del movimiento
progresivo de los mismos.
Motilidad
individual progresiva:
En esta prueba se utiliza semen diluido, se prepara un frotis con el semen
diluido, previamente el portaobjeto el cubreobjeto debe ser calentado en la
platina, luego se analiza en el microscopio. Se evalúa velocidad y porcentaje
de espermatozoides, de acuerdo a la siguiente escala.
VELOCIDAD
|
CARACTERÍSTICA
|
0
|
Sin movimiento
|
1
|
Leve movimiento de cola sin desplazamiento
progresivo
|
2
|
Leve movimiento de cola con algo de
desplazamiento progresivo
|
3
|
Movimiento progresivo a velocidad lenta
|
4
|
Movimiento progresivo rápido
|
5
|
Movimiento progresivo rápido donde es
difícil seguir un espermatozoide
|
Fuente:
Apuntes de Obstetricia y Fisiopatología de la Reproducción
PORCENTAJE (%)
|
VALORACIÓN
|
80-100 de células móviles
|
Muy buena
|
60-79 de células móviles
|
Buena
|
59-40 de células móviles
|
Regular
|
Menos 40 de células móviles
|
Mala
|
Fuente:
Apuntes de Obstetricia y Fisiopatología de la Reproducción
En cuanto a la velocidad, hay que descartar
muestras de velocidad 2 o menor; en cuanto al porcentaje, se acepta una
valoración buena-muy buena, pudiendo aceptarse una valoración regular.
Esta prueba nos da información acerca de la
integridad de membrana y de la morfología espermática.
RELACIÓN ENTRE MOTILIDAD EN MASA Y MOTILIDAD
INDIVIDUAL
|
||
MOTILIDAD EN MASA
|
CATEGORIA
|
MOTILIDAD INDIVIDUAL
|
Remolinos rápidos
|
Muy buena
|
≥ 70%
|
Remolinos lentos
|
Buena
|
50-69%
|
Oscilación general
|
Aceptable
|
30-49%
|
Oscilación esporádica
|
Mala
|
≤30%
|
Procesado, envasado y congelado del semen
Luego de la evaluación del semen, tanto microscópica como
macroscópica, se lleva a cabo el procesado del mismo; algunas de las
finalidades de este proceso son: aumentar el volumen del eyaculado, con esto
vamos a tener mayor número de dosis a congelar y una mayor cantidad de hembras inseminadas;
proteger, conservar y mantener fértil a los espermatozoides por más tiempo; fraccionar y almacenar, por
distintos métodos, el semen; etc. Este proceso incluye, el cálculo de dosis
(dependiendo el método de envasado que se emplee), dilución al volumen
requerido, agregados de distintas sustancias, “envasado” y por último el
proceso de vitrificación.
Cuando se realiza el cálculo de dosis, también se saca el
volumen del diluyente a agregar, los cálculos que se realizan son los
siguientes:
VR x CE = DF x CF
VR=
volumen recolectado
CE=
concentración del eyaculado
DF=
dilución final
CF=
concentración final
Ejemplo:
Eyaculado de 10
ml con una concentración de 1700 x 106 y una concentración por
pajuela de 0.5 ml de 30.000 de espermatozoides
5 x (1700 x 106) = DF x 60 x 106 (ya que son 60.000 por ml porque la pajuela es de
30.000 y tienen 0.5 ml)
DF = 5 ml x 1700 x 106 =
141.6 ml o sea 283 dosis
60 x 106
Volumen de diluyente a agregar: 141.6
ml – 10 ml = 131.6 ml (los 10 ml es el volumen del eyaculado).
Este cálculo es
de ejemplo cuando se va a envasar el semen en pajuelas de 0.5 ml, que es el
método Cassou. También existen otros métodos como Minitubos, ideado por Simmet
(que no se utiliza en nuestro país) y el método de Pastillas, ideado por Nagase
y Niwa. Actualmente en nuestro país el método más utilizado es el Francés o de
Cassou.
Una vez realizado
el cálculo, se lleva a cabo el agregado del diluyente y otras sustancias que
van a aumentar el volumen del eyaculado, y van a mejorar la sobrevida de los
espermatozoides.
Los diluyentes
que se agregan generalmente son del tipo tris, estos deben contener sustancias
iónicas (salinas) o no iónicas (glúcidos), para que mantengan la osmolaridad
del medio, lo más cerca posible de la osmolaridad fisiológica; también tienen
que tener, sustratos para el metabolismo del semen (fuente de energía), como
fructosa o glucosa; sustancia que controlen la acidez, como buffers (plasma
sanguíneo, leche, etc.); una fuente de lipoproteína de alto peso molecular, que
protege al semen del golpe de frío, generalmente se utiliza yema de huevo,
leche descremada, albumina sérica bovina, etc.; antibióticos (penicilina,
estreptomicina, polimixina B, etc.) para inhibir la proliferación de
microorganismos; y por ultimo un agente crioprotector, este cumple la función
de reducir la formación de cristales de hielo alrededor de la membrana del
espermatozoide. Básicamente tenemos penetrantes y no penetrantes.
Los
crioprotectores penetrantes son de bajo peso molecular y permeable a la
membrana celular, ingresan rápidamente a través de la membrana, donde modula la
estabilidad y fases de la bicapa fosfolipídica, de esta forma previenen la
acumulación excesiva de electrolitos y otras sustancias durante el proceso de
congelación, y la formación de cristales de hielo en dicho proceso. Ejemplos de
ellos tenemos: glicerol, etilén-glicol (EG), dimetilsulfóxido (DMSO) y
propanodiol (PROH).
Los
crioprotectores no penetrantes son de alto peso molecular, generalmente son
polímeros que forman puentes de hidrógeno con el agua, efectivos a altas
velocidades de congelamiento, ya que promueve la rápida deshidratación celular,
y suelen ser utilizados asociados a agentes penetrantes. Los más utilizados
son: sacarosa, polivinil-pirrolidona (PVP), polietilen-glicol (PEG) dextrosa y
dextrano.
El crioprotector
más utilizado hoy en día, el es glicerol a una concentración final del 7%, en
el diluyente. Algunas de las combinaciones mas se utilizadas hoy en día de los
diluyentes son, citrato-yema de huevo-glucosa, yema de huevo-tris-fructosa,
citrato-leche entera homogenizada, etc.
Los diluyentes se
pueden presentar en una fracción, o en dos fracciones.
En el caso de que
venga en una fracción, se le agrega al semen inmediatamente luego de colectado,
es recomendable agregarle el diluyente al semen, en forma suave y sin agitar,
ambos tienen que estar a la misma temperatura, aproximadamente 34 ° C, esto se
logra manteniéndolos a baño maría. Generalmente cuando se presenta en una
fracción contiene glicerol al 7 % como crioprotector.
En el caso que el
diluyente se presente en dos fracciones, se agregan dichas fracciones a
distinta temperatura, la fracción A, sin glicerol, se agrega a 34°C aproximadamente, igual que en el caso
anterior, luego se disminuye la temperatura del semen diluido con la fracción
A, hasta 4-5°C aproximadamente, esto se llama enfriamiento del semen, y se
puede hacer en un freezer a -18°C durante 30 minutos, o en heladera durante dos
horas hasta alcanzar la temperatura deseada. Luego se le agrega la fracción B,
con glicerol, a esa temperatura, esto se realiza dentro del freezer, heladera,
o manteniendo la temperatura del ambiente del laboratorio en 4°C.
Ejemplos de las
fracciones del diluyente:
FRACCION A (sin glicerol)
|
FRACCION B (con glicerol)
|
||
INGREDIENTE
|
CANTIDAD
|
INGREDIENTE
|
CANTIDAD
|
Citrato de sodio
|
1856 g
|
Citrato de sodio
|
1856 g
|
Glucosa
|
1.0 g
|
Glucosa
|
1.0 g
|
Agua destilada
|
Hasta 80 ml.
|
Agua destilada
|
Hasta 66 ml.
|
Yema de huevo
|
20 ml.
|
Yema de huevo
|
20 ml.
|
Glicerol
|
14 ml.
|
||
PH 7.0 con HCL
|
PH 7.0 con HCL
|
||
COMPONENTE
|
FRACCION A
|
FRACCION B
|
CONCENTRACION FINAL
|
Tris (hidroximetil-aminometano)
|
1.21 g
|
1.21 g
|
2,42 %
|
Acido cítrico
|
0.69 g
|
0.69 g
|
1,8 %
|
Fructosa
|
0.5 g
|
0.5 g
|
1,0 %
|
Yema de huevo
|
10 ml
|
10 ml
|
20 %
|
Glicerol
|
-
|
7 ml
|
7 %
|
Agua destilada
|
50 ml
|
50 ml
|
-
|
Luego de agregar
la fracción B, se debe esperar un tiempo de 3 a 6 horas aproximadamente, este
tiempo se conoce como período de estabilización, en el cual el crioprotector
penetra las membranas de los espermatozoides para protegerlos de los daños que
se pueden generar durante la congelación y la descongelación.
Comúnmente antes del período de estabilización se procede al llenado y sellado de las pajuelas. El llenado se realiza, generalmente, con una bomba de vacío y el sellado de las pajuelas se puede hacer, con un polvo sellador a base de polietileno, o con alcohol polivinilico. También se puede realizar con envasadoras automáticas.
Envasadora
automática. FUENTE: 3tres3.com
Hay que recordar
que se está explicando el proceso para el método francés o de Cassou, debido
que actualmente se utiliza más en nuestro país y a nivel mundial.
Una vez
finalizado el período de estabilización se lleva a cabo el congelado del semen.
Hay diversos
métodos para realizar el congelado, se pueden utilizar congeladores
programables (Imagen 16), en los cuales circulan vapores de nitrógeno liquido
en una tasa controlada, o se puede utilizar un método sencillo y relativamente
fácil, que es el que se describirá a continuación, y es el que se utiliza
comúnmente en todos los centros de congelación de semen de nuestro país. El
mismo consiste en suspender las pajuelas por encima del nitrógeno liquido, a
una altura de unos 4 o 5 cm., de esta forma se enfrenta a las pajuelas a los
vapores del nitrógeno liquido, por un lapso de 10 minutos, a una temperatura
aproximada de -120°C, este proceso de llama precongelación. Luego de este
tiempo se procede a introducir las pajuelas directamente en nitrógeno liquido,
este proceso de denomina congelación, y se realiza a -196°C, que va a ser la
temperatura final de almacenamiento. Imagen 17, 18 y 19.
Imagen 16 FUENTE:
http://ventas.sanantonio-abad.com/product.php?id_product=28
Imagen 17, equipo
para congelar semen. FUENTE: http://biotecnologia2008.es.tl/BIOTECNOLOGIA-REPRODUCTIVA.htm
Hay que recordar
que el nitrógeno líquido de almacena en termos térmicos especiales (imagen 20).
Luego de congelados las pajuelas se almacenan en los mismos termos térmicos
especiales, generalmente en gobelets (“vasos plásticos”), para 5 unidades, que
se montan en cañas de dos pisos cada una, serian 10 unidades en cada caña, o en
gobelets de 100 unidades (imagen 21). Si se mantienen las condiciones del
medio, las dosis pueden durar muchos años, hay que tener en cuenta el llenado
correcto del termo con nitrógeno liquido, revisaciones periódicas del mismo,
las cuales nos informaran de algún inconveniente que pueda presentar el termo,
como que este pinchado, etc.
Una vez ya congelado
el semen y almacenado correctamente, está listo para ser utilizado en
inseminación artificial, o simplemente que quede almacenado como banco genético.
Imagen 22.
Conclusión
Esta biotecnología ha tenido grandes avances
en el tiempo desde que se empezó a utilizar, tanto en aspectos de manejo,
comercialización, de investigación, de materiales y métodos para la realización
de la misma, de almacenamiento, de controles sanitarios, etc. Sin embargo hay
un punto en el cual, si bien se ha avanzado tecnológicamente y en cuanto a su
investigación, no se ha podido implementar masivamente en la práctica, que es
el método para realizar el congelado propiamente dicho, ya que la simplicidad,
facilidad, y bajo costo de esta técnica ha hecho que perdure en el tiempo y en
los grandes centros de extracción de semen, el único inconveniente que presenta
esta técnica, es que al enfrentar las pajuelas a los vapores de nitrógeno,
éstas no reciben la misma cantidad de vapor uniformemente, y por ende, hay
variaciones mínimas de temperatura en el proceso, pero según algunos estudios
dicen que no se afecta la fertilidad del semen. Creo que éste es un punto a
mejorar en el futuro de ésta biotecnología.
Con respecto a las ventajas que tiene la
utilización del semen congelado, se sabe que son muchas, y debido a esto se
incrementa el uso de semen congelado año a año. Entre algunas de las ventajas
que se pueden mencionar son, el bajo costo de una dosis, en relación a lo que
sería criar un toro y mantenerlo; que se puede utilizar genética superior de
distintas partes del mundo, o de distintas partes del país, a un costo mínimo,
si se compara al transporte de un toro vivo; la seguridad en cuanto a la
sanidad que posee ese semen; etc. También posee desventajas como todo, pero si
se evalúa la relación al costo/beneficio, se obtienen mayores beneficios a
mediano y largo plazo, que el costo inicial y anual que tiene.
Con respecto a los métodos que se emplean en el
congelado del semen, si bien dan buenos resultados los tres que actualmente
tienen vigencia, el método francés o de Cassou les ha sacado cierta ventaja,
debido a la simplicidad que posee, la seguridad en cuanto a los aspectos
sanitarios, la facilidad de almacenamiento, la practicidad para el
descongelamiento, y posterior inseminación, etc. Debido a esto y a otras cosas,
es el método estándar que actualmente se utiliza nuestro país y el mundo.
El método de Simmet, generalmente se utiliza
en Alemania, en nuestro país no ha tenido un desarrollo importante.
En cuanto al método de las pastillas,
realizado por Nagase y Niwa, se utilizaba mucho en nuestro país hace varios
años atrás, pero fue perdiendo terreno por el método francés debido a lo dicho
anteriormente, y porque el sistema de pastillas era engorroso su
almacenamiento, además no certificaba una sanidad importante, ya que todas las
pastillas permanecen en los termos de nitrógeno líquido, juntas, y no están
aisladas de la suciedad que pueda poseer el termo, etc. Además para su
descongelamiento es necesario diluirlas, y es mucho más engorroso el proceso,
por esto es que el método francés es el método estándar en nuestro país y
generalmente en el mundo.
Con respecto al futuro de estas biotecnologías
(congelado y utilización del semen), creo que va a ser muy importante, debido a
los grandes avances que podemos hacer en nuestros rodeos, como así también se
puede utilizar para realizar bancos genéticos (hay que recordar que las dosis
de semen en condiciones adecuada tienen sobrevida de muchos años) de animales
de alto mérito genético, de animales muertos, de animales que por alguna razón
no pueden ser utilizados para dar servicio, etc. Por esto y muchas cosas más es
que estas biotecnologías han venido para quedarse y van a ir ganando espacio en
la medida que sean aplicadas correctamente y de una manera responsable, tanto
como por parte de los profesionales como de los propietarios de los rodeos.
Siempre y cuando el contexto económico que las rodee les sea beneficioso.
Bibliografía
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HAFEZ B., Reproducción e
Inseminación Artificial en animales, 2002
- INSTITUTO DE
REPRODUCCIÓN ANIMAL DE CÓRDOBA, 4º
Simposio Internacional de Reproducción Animal, 2001
- PÉREZ Y PÉREZ,
Reproducción Animal: Inseminación
Artificial y Transferencia Embrionaria, 1985
- ROBERTS S.J.,
Obstetricia Veterinaria y Patología
de
- CÁTEDRA DE
OBSTETRICIA Y FISIOPATOLOGIA DE LA REPRODUCCIÓN, FACULTAD DE CIENCIAS
VETERINARIAS, UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PAMPA, Apuntes internos, 2010
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